UJI KOEFISIEN FENOL

Pada tahun 1817, Joseph Lister menggunakan desinfektan yang mengandung persenyawaan fenol, yaitu asam karbol untuk mendesinfeksi peralatan bedahnya. Sampai sekarang pun, fenol digunakan sebagai larutan baku penentu keampuhan desinfektan.

Keampuhan bahan antimicrobial sering kali dibandingkan dengan fenol, fenol sering digunakan untuk mematikan mikroorganisme. Koefisien fenol adalah cara mengukur keampuhan bahan anti microbial di bandingkan fenol. Koefisien fenol kurang dari 1, berarti bahwa bahan antimicrobial tersebut kurang efektif dibandingkan fenol. Sebaliknya koefisien fenol lebih besar dari 1 menunjukan bahwa bahan ini lebih ampuh di bandingkan fenol. Koefisien fenol ditentukan dengan cara membagi pengenceran tertinggi dari fenol yang mematikan mikroorganisme dalam 10 menit tetapi tidak mematikanya dalam waktu 5 menit (misalkan pada pengenceran 1 : 90) terhadap pengenceran tertinggi bahan antimicrobial yang mematikan mikroorganisme dalam 10 menit tetapi tidak mematikannya dalam waktu 5 menit (misalkan pada pengenceran 1 : 350). Koefisien dari bahan antimicrobial tersebut adalah (1 : 90) : (1 : 350) = 3.89.

Mikroorganisme penguji yang dipakai dalam penguji ini adalah Staphylococcus aures .

Bahan yang diperlukan :

      Biakan kaldu yang mengandung Staphilococcus aureus (24 jam)

      Fenol (asam karbolat)

      Aquadestillata lisol (79% etil alcohol)

      Pipet steril berukuran 5 mL dan 1 mL

      Tabung TSB (Trypticase Soy Broth)

Cara mengerjakan :

Hari pertama

1.      Encerkan fenol dalam Aquadestillata steril sehingga diperoleh pengenceran 1 : 80, 1 : 90, 1 : 100, dan 1 : 110.

Masukan 5 mL dari setiap pengenceran ini dalam tabung. Beri tanda  pengenceran pada setiap tabung.

Inokulasi setiap pengenceran dengan 0.5 mL kaldu biakan (24 jam) organisme penguji, yaitu S. aureus.

2.      Encerkan bahan antimicrobial (desinfektan lisol) dengan Aquadestillata steril sehingga diperoleh pengenceran 1 : 150; 1 : 200; 1 : 250; 1 : 300; 1 : 350; 1 : 400; 1 : 450; 1 : 500. masukan 5 mL dari setiap pengenceran kedalam tabung. Beri tanda pengenceran pada tabung. Inokulasi setiap tabung pengenceran dengan 0.5 mL kaldu biakan S.aureus berumur 24 jam. Inkubasikan pada suhu 20⁰C

3.      dalam rentang waktu 5, 10, dan 15 menit pindahkan 1 mata ose dari tabung pengencer ini ke kaldu TSB yang steril. Kocok baik-baik tabung yang berisi biakan ini. Inkubasikan kaldi selama 24-48 jam pada suhu 35⁰C. pemindahan satu mata ose berlaku bagi tabung pengenceran yang berisi fenol maupun desinfektan.

Hari kedua dan ketiga :

1.      kocok tabung baik-baik .tentukan tabung pengenceran yang menunjukan pertumbuhan (+) dan tabung pengenceran yang tidak menunjukan pertumbuhan (-). Hasil disajikan dalam bentuk table.

2.      tentukan nilai koefisien fenol.

III.1.    Uji koefisien Fenol Metode Broth

Prinsip : Membandingkan daya bunuh desinfektan dengan daya bunuh dari baku fenol terhadap bakteri uji yang sama pada kondisi yang sama dalam masa kontak 5, 10, 15 menit.

a.  Pereaksi khusus

Media dan pengencer :

Nutrien Broth

Air steril 
Bakteri uji  
Salmonella typhy ATCC 6539

b. Peralatan khusus

1. Tabung reaksi berbibir ukuran 25 x 150 mm dan 20 x 150 mm

2. Sengkalit platina diameter 4 mm

3. Pencatat waktu

4. Rak tabung isi 40 tabung

c. Prosedur

Pembuatan  media

Dibuat media Nutrien Broth (NB) dengan komposisi per Liter terdiri dari :

Peptone                  10 g

Beef Extract             5 g

NaCl                         5 g

pH akhir 6.8 dimasukan dalam tabung 20 x 150 mm, masing-masing 10 mL, sterilisasi 121^o, 1 atm selama 15 menit.

Bakteri Uji

Bakteri Salmonella typhi ditanam pada media NA miring, di inkubasikan pada suhu 37^oC selama 24-48 jam. Biakan dari NA ini diinokulasikan pada media NB dan di inkubasikan pada suhu 37^oC selama 24 jam . bakteri yang digunakan dalam pengujian adalah biakan NB hasil peremajaan 4 kali dalam 4 hari berturut-turut, dan batas maksimal peremajaan adalah 30 kali. Bakteri yang akan digunakan dikocok dan didiamkan selama15 menit.

Larutan baku fenol 5 %

Dibuat larutan baku fenol 5 % b/v. kemudian diencerkan dengan perbandingan 1:80, 1:90, 1:100 dalam tabung steril ukuran 25 x 150 mm. volume larutan ini 5 mL tiap tabung. Larutan baku fenol 5% yang digunakan harus sudah dibakukan terlebih dahulu.

Larutan desinfektan

Dibuat larutan desinfektan didalam air steril, besarnya pengenceran disesuaikan sedemikian rupa (sesuai etiket) sehingga berada pada jarak daya bunuh terhadap bakteri uji selama masa kontak 5 sampai 15 menit. Sebagai contoh adalah 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:300, 1:350, 1:400. pengenceran dibuat dalam tabung reaksi steril ukuran 25 x 150 mm. volume tiap pengenceran disinfektan yang diperlukan untuk pengujian ini 5 mL tiap tabung.

Prosedur

Semua tabung pengenceran baku dan disinfektan ditempatkan pada 1 deret rak tabung.

Dibelakang tiap tabung pengenceran disediakan 3 tabung media Nutrient Broth. Sehingga untuk 10 tabung pengenceran ( 3 tabung pengencer baku fenol dan 7 tabung pengenceran disinfektan ) diperlukan 30 tabung media NB.

Semua tabung pengenceran dan NB ( 40 tabung ) ditempatkan dalam tangas es suhu 20^oC dan suhu tersebut dipertahankan terus selama pengujian. Biakan bakteri uji dikocok dan ditaruh dalam tangas es, dibiarkan selama 15 meit sebelum digunakan.

Kedalam tiap tabung pengenceran dimasukan 0,5 mL suspensi bakteri uji dengan menggunakan pipet ukur steril. Pada saat pertama kali dimasukan suspensi bakteri uji pada tabung pertam, waktu dicatat sebagai nol menit. Kemudian dilanjutkan dengan inokulasi suspensi bakteri kedalam tabung pengenceran kedua dengan interval waktu 30 detik dari inokulasi pertama. Demikian juga tabung-tabung pengenceran ketiga sampai dengan kesepuluh.

Kesepuluh tabung pengenceran dapat diselesaikan dalam waktu 4,5 menit.

Pada saat memasukan suspensi bakteri uji kedalam tabung, pipet diturunkan hingga mendekati permukaan cairan dan tidak sampai menyentuh dinding tabung. Lima menit setelah pengisian suspensi bakteri uji kedalam tabung, dilanjutkan dengan inokulasi satu sengkelit dari masing-masing pengenceran kedalam tabung NB deret pertama, dengan interval waktu 30 detik untuk setiap pengenceran.

Ketika akan mengambil cairan yang akan diinokulasikan, dikocok dahulu dan tabung dipegang dalam posisi miring bersudut kurang lebih 60^o . setiap kali melakukan pemindahan/inokulasi, sengkelit harus dibakar terlebih dahulu sampai pijar dan mulut tabung juga dibakar. Sepuluh menit setelah pengisian bakteri uji pada tabung pengenceran pertama, dilakukan inokulasi secara berturut-turut kedalam tabung-tabung media NB ke-11 sampai ke-20. lima belas menit setelah pengisian bakteri uji pada tabung pertama, dilakukan inokulasi berturut-turut kedalam tabung NB ke-21 sampai ke-30. semua tabung media yang telah diinokulasi bakteri uji, diinokulasi pada suhu 37^oC selama 48 jam. Kemudian diamati ada atau tidaknya pertumbuhan bakteri pada setiap tabung. Hari ketiga inkubasi, dilakukan uji kemurnian bakteri yang digunakan. Hal ini dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya kontaminasi bakteri uji.

Perhitungan

Koefisien fenol adalah hasil bagi dari faktor pengenceran tertinggi disinfektan dengan faktor pengenceran tertinggi baku fenol yang masing-masing dapat membunuh bakteri uji dalam jangka waktu 10 menit tetapi tidak membunuh pada jangka waktu 5 menit.

Koefisien Fenol  =	Pengenceran tertinggi zat kimia uji yang mematikan dalam waktu 10 menit tetapi tidak mematikan dalam waktu 5 menit
	Pengenceran tertinggi larutan fenol yang mematikan dalam waktu 10 menit tetapi tidak mematikan dalam 5 menit

Pengamatan  hasil

a.       jika koefisien fenol yang diperolah dikalikan dengan faktor 20 menghasilkan angka yang lebih kecil dari angka pengenceran yang tertera pada etiket, maka pengenceran disinspektan tidak memenuhi syarat.

b.      Pada koefisien yang diperoleh dikalikan dengan faktor 20 menghasilkan angka yang sesuai dengan angka pengenceran yang tertera pada etiket, maka pengenceran disinspektan tidak memenuhi syarat.

III.2.    UJI KOEFISIEN FENOL METODE LEMPENG.

(SNI 06-1872-1990)

Prinsip : mengukur daya pemusnah hama/ disinsfektan pemusnah hama dari   contoh terhadap pemusnah hama dari fenol

a.       Pereaksi khusus

Media dan Pereaksi

• Nutrien Agar (NA)
• Baku Fenol

Bakteri uji

• Biakan murni Salmonella typhi

b.      Peralatan khusus

• Tabung kimia
• Cawan Petri
• Jarum ose/ dawai platina
• Inkubator

c.       Prosedur

1.      Buat pengenceran dari 5 % contoh dari 1 : 300;  1 : 325 ; 1:350; 1 : 375 ;  1 : 400, masing 5 ml, pengenceran dengan air suling

2.      Buat pengenceran dari 5 % setandar menjadi 1 : 90 ; 1 : 100 masing-masing 5 ml.

3.      Tabung-tabung yang berisi contoh, fenol dan biakan Salmonella typhi  ( test culture) ditempatkan dalam inkubator pada suhu 35 sampai 37^O C selama 24 jam.

4.      Tiap 30 detik ke dalam masing-masing tabung ditambahkan ½ ml. “test culture”.

5.      Kocok kuat-kuat supaya bakteri menyebar

6.      Sesudah 5 menit dengan jarum ose kemudian inokulasikan pada Nutrien Agar dalam Cawan petri.

7.      Selanjutnya 5 menit kemudian diambil lagi dan inokulsikan pada  NA (untuk pengamatan 10 menit), 5 menit setelah itu pengamatan diambil lagi untuk pengamatan 15 menit.

8.      Inkubasi cawan Petri dalam incubator 37^OC selama 84 jam dan amati hasil pertumbuhan bakteri pada 5 menit, 10 menit, 15 menit.

9.      Hitung koefisien fenol

III.3.    Daya Germisida Atau Aktivitas Disinfektan

Dilihat cara aktivitasnya, disinfektan ada 3 golongan yaitu :

a.       Disinfektan tingkat tinggi adalah yang efektif terhadap bakteri vegetatif dan spora. Disinfektan ini digunakan untuk mendisinfeksi alat-alat kritis yang tidak cocok jika steril dengan cara pemanasan misalnya alat-alat plastic. Yang termasuk kedalam golongan ini adalah adalah Formaldehid 8% dalam alcohol, Glutaraldehid yang efektif terhadap bakteri vegetatif 2% dalam air alkali dan gas etilenoksida

b.      Disinfeksi tingkat menengah adalah yang efektif terhadap bakteri vegetatif. Disinfektan ini digunakan untuk mendisinfeksi alat-alat semi kritis endoskopik, tabung aspirator, thermometer, alat-alat terkontaminasi seperti bekas urine, kotoran, pembedahan, dll. Bahan disinfektan untuk ini bisa digunakan derivate fenol, hipokliorid dan Formaldehid.

c.       Disinfektan tingkat rendah adalah yang efektif terhadap bakteri vegetatif. Disinfektan ini digunakan untuk mendisinfeksi alat-alat non kritis dan semi kritis seperti permukaan alat pengangkut, dinding, kamar mandi. Yang termasuk golongan ini adalah iodopors, Benzalkonium klorida, cetrimida, kloroheksan, dll

DAYA KERJA DESINFEKTAN

Bahan yang diperlukan:

Biakan                  : Staphylococcus aureus

                                  Salmonella typhimurium

Media                    : Agar dalam tabung

Desinektan          : I  – Fenol 5%

                                  II – Lisol

                                 III – Axi

                                 IV – Hipoklorit 5,25%

                                 V – Alkohol 70%

Cakram Kertas

Cara mengerjakan:

1. Ambil 2 tabung agar yang telah dicairkan.

2. Inokulasi masing-masing tabung dengan biakan yang disediakan

3. Tulis nama desinfektan dan nama bakteri pada cawan petri.

4. Kocoklah tabung di antara dua telapak tangan, kemudian tuang ke cawan petri. Biarkan agar membeku (10-15 menit).

5. Ambil cakram kertas dengan pinset, kemudian celupkan dalam larutan desinfektan yang disediakan. Letakan cakram kertas pada permukaan lempengan agar. Perhatikan bahwa jarak antara cakram kertas harus cukup jauh.

6.eramkan dalam lemari pengeram  (37⁰C) selama 48 jam.

7.Ukurlah luas daerah jernih. Pengukuran dilakukan dari dasar cawan petri

8. Bandingkan daya kerjaberbagai desinfektan terhadapkedua bakteri.

               

Desinfektan	S. aureus	S. typhimurium
Desinfektan I
Desinfektan II
Desinfektan III
Desinfektan IV
Desinfektan V

KOEFISIEN FENOL         

Bahan yang diperlukan:

Biakan kaldu yang mengandung Staphylococcus aureus (24 jam)

Fenol (Asam karbolat)

Aquadestillata steril

Desinfektan lisol (79% etil alcohol)

Pipet steril berukurn 5 ml dan 1 ml

Tabubg TSB (Trypticase Soy Broth)

Cara mengerjakan:

1. Encerkan fenol dalam aqudestillata steril sehingga diperoleh pengenceran 1: 80, 1: 90,   1: 100, 1 : 110.

     Masukan 5 ml dari setiap pengenceran ini dalam tabung. Beri tanda penegenceranpada setiap tabung.

     Inokulasi setiap penenceran dengan 0,5 ml kaldu biakan (24 jam) organisme penguji yaitu S. aureus.

2. Encerkan bahan antimikrobial (desinfektan lisol) dengan aquadestillata) steril sehingga diperoleh pengenceran 1 : 100, 1 : 150, 1: 200, 1: 250, 1 : 300, 1 : 350, 1: 400, 1 : 450, 1 : 500. masukan 5 ml dari setiap pengenceran ke dalam tabung. Beri tanda pengenceran pada tabung.

     Inokulasi setiap tabung pengenceran denan 0,5 ml kaldu biakan S. aureus berumur 24 jam.Inkubasikan pada suhu 20⁰C.

3. dalam rentang waktu 5, 10 dan15 menit pindahkan satu mata ose dari tabung pengencer ini ke kaldu TSB yang steril. Kocok baik-baik tabung yang berisi biakan ini. Inkubasikan kaldu selama 24 – 48 jam pada suhu 35⁰C.

     Pemindahan satumata ose berlaku bagi tabung pengenceran yang berisi fenol maupun desinfektan.

Hari Kedua dan hari Ketiga

1. Kocok tabung baik-baik Tentukan tabung pengenceran yang menunjukkan pertumbuhan (+)  dan tabungpengenceranyang tidakmenunjukkan pertumbuhan (-). Hasil disajikan dalam bentuktabel.

2. Tentukan nilai koefisien fenol.

     Hari pertama

    

Bahan kimia	Fenol
Pengenceran	1:80        1:90         1:100        1:110

Bahan kimia	Desinfektan yang diuji
Pengenceran	1:100              1:500

Hari Kedua

Bahan Kimia	Fenol
Pengenceran	1:80      1:90      1:100         1:110

Bahan Kimia	Desinfektan yang diuji
Pengenceran	1:100                                 1:500

ANTIOGRAM – METODE KIRBY – BAUER

Bahan yang diperlukan:

Biakan: Escherichia coll

                Staphylococcus aureus

                Pseudomonas aeruginosa

Media: Lempengan Mueller-Hintomn agar

Cara mengerjakan:

Hari pertama

1. Tandai satulempengan agar dengan nama, tanggal dan mikroorganisme yang akan diuji.

2. Celupkan tangkai kapas (cotton swab) dalambiakan mikroorganisme, kemudian putar bagian kapas ke sisi tabung agar cairan tidak menetas dari bagian kapas tersebut.

3. Sebar mkroorganisme pada seluruh permukaan lempengan agar. Untukmendapatkan pertumbuan yang merata, gores secaramendatar, kemudian putar lempengan 90⁰ danbuat goresan kedua, putarlempengan 45⁰  dan buat gorean ketiga.

4.Biarkan lempengan mongering selama 5 menit, kemudian tempatkan cakram kertas yang berisi antibiotik padapermukaan lempengan.

5. Gunakan 5-6 macam antibiotik untuk mengetahui kepekaan mikroorganisme terhadap antibiotik. Jarak abtara cakram kertas harus cukup luas,  sehingga wilayah jernih tidak beerhimpitan.

6. Cakram kertas ditekan dengan menggunakan pinset pada permukaan lempengan, sehingga terdapat kontak yang baik anatar cakram dan lempengan agar. Cakram tidak perlu ditekan kuat-kuat sehingga melukai permukaan agar.

7. Inkubasi lempengan pada suhu 35⁰C  selama 24 jam.

Hari Kedua

Ukur luas wilayah jernih untuk setiap antibiotik yang diuji. Bandingkan dengan table     

Laporkan hasil pengujian!

Untuk setiap antibiotik tentukan keampuhnnya.

Antibiotik	Mikroorganisme yang diuji	Diameterwilayah jernih	Kesimpulan pengujian
Penicillin	S. aureus E. Coli P. aeruginosa
Stepromycin	S. aureus E. Coli P. aeruginosa
Gentamycin	S. aureus E. Coli P. aeruginosa
Tetracyclin	S. aureus E. Coli P. aeruginosa
Chloramphenycol	S. aureus E. Coli P. aeruginosa

        

DAYA OLIGODINAMIK

Bahan yang diperlukan:

Biakan: Escherichia coli

                Staphylococcus aureus

Media: agar tuang dalam tabung (20 ml)

Mata uang perunggu, tembaga, dan perak

Cara mengerjakan:

1.   Cairkan 6 tabung agar  tuang.

2.   Sediakan mata uang yang telah disterilkan dan mengandung tembaga, perunggu dan perak.

3.   Inoklasi asing-masing tabung dengan biakan yang telah disediakan.

4.   Tuangkan setengah isi tabung ke dalam cawan petri.

     Biarkan agar lempengan mengeras.

     Tandai agar lempengan dengan nama biakan dan jenis mata uang yang dugunakan.

5. Tempatkan mata uang dengan menggunakan pinset di bagian tengah agar lempengan.

6. Tuangkan sisi isi tabung ke dalam cawan petri dengan hati-hati, agar letak mata uang tidak bergeser.

7. Masukan dalam lemari pengeram 37⁰C selama 48 jam.

8. Bandingkan daerah jenih sekitar mata uang dan laporkan hasilnya.

Mikroorganisme	Mata Uang   Tembaga      Perunggu      Perak
E. coli
S. aureus

Langkah-langkah dalam proseur laboratories untuk menetapkan kerentanan suatu bakteri terhadap antibiotik (A) sebuah koloni bakteri “dicutik” dari cawan petri dengan jarum pindah dan (B) koloni tersebut disuspensikan di dalam beberapa milliliter kaldu steril. (C) Sebatang pengulas terbungkus kapas dicelupkan ke dalam suspensi bakteri tadi dan digunakan untuk menginokulasi permukaan medium agar dalam cawan petri. (D) Sebuah alat mekanis digunakan untuk menaruh piringan-piringan kertas kecil, masing-masing telah diserapi dengan antibiotik yang berbeda-beda, pada permukaan cawan yang telah diinokulasi tadi. (E) setelah inkubasi, biakan cawan petri itu diperiksa untuk melihat  ada tidaknya zone penghambatan disekitar piringan-piringan antibiotik tersebut. Bila uji ini dilakukan di bawah keadaan yang betul-betul terkendali, akan terlihat adanya hubungan antara  ukuran zone penghambatan  (area jernih) dan kerentanan bakteri  yang bersangkutan terhadap antibiotik yang mengakibatkan terbentuknya zone tersebut. (atas kebaikan Lilly Research Laboratories, Division of Eli Lilly and Company)