Penentuan [Paracetamol] Metode HPLC

        I.            Judul Praktikum                                                : Penentuan Kadar Paracetamol metode HPLC

      II.            Tanggal Praktikum                           : Senin, 5 Mei 2014

    III.            Tanggal Laporan                               : Selasa, 4 Mei 2014

    IV.            Tujuan Praktikum                            :

Dapat menentukan %paracetamolmetode HPLC

      V.            Prinsip Percobaan                            :

Sample dilarutkan dalam Aqua DM, lalu sample disaring denagn kertas saring khusus (44mm : 0,46 pi m). Hasil saringan dianalisa dengan HPLC dimana fasa geraknya metanol : Aqua DM (3:7) menggunakan detektor dengan panjang gelombang 272 nm, menggunakan kolom kromasi /100-5618 dengan sistem pengaliran fasa geraknya isoleratik. Hasil pengukuran menunjukan konsentrasi larutan.

    VI.            Dasar Teori                                         :

Pengertian HPLC

HPLC (High Performance Liquid Chromatography)a atau biasa juga disebut dengan Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) , HPLC adalah metode analisis yang populer karena mudah untuk dipelajari dan digunakan dan tidak dibatasi oleh volatilitas atau stabilitas senyawa sampel. sejarah bagian HPLC menggambarkan evolusi dari tahun 1970 ke tahun 1990-an. HPLC modern memiliki banyak aplikasi termasuk pemisahan, identifikasi, pemurnian, dan kuantifikasi dari berbagai senyawa. 

Sebelum tahun 1970-an, beberapa metode kromatografi dapat diandalkan komersial tersedia untuk ilmuwan laboratorium. Selama 1970-an, sebagian besar pemisahan kimia dilaksanakan menggunakan berbagai teknik termasuk terbuka kromatografi kolom, kromatografi kertas, dan kromatografi lapis tipis. . Namun, teknik-teknik kromatografi ini tidak memadai untuk kuantifikasi senyawa dan resolusi antara senyawa yang serupa. Selama waktu ini, kromatografi cairan tekanan mulai digunakan untuk mengurangi flowthrough waktu, sehingga mengurangi waktu pemurnian senyawa yang terisolasi oleh kolom chromatogaphy.

Namun, laju aliran tidak konsisten, dan pertanyaan apakah lebih baik untuk memiliki laju aliran konstan atau tekanan konstan diperdebatkan. (Analytical Chem. vol 62, no. 19, oct 1 1990). (Analytical Chem. Vol 62, no. 19, 1 Oktober 1990). Kromatografi cairan tekanan tinggi dikembangkan pada pertengahan tahun 1970-an dan segera ditingkatkan dengan pengembangan bahan kemasan kolom dan kenyamanan tambahan on-line detektor. Pada akhir 1970-an, metode baru termasuk fase terbalik kromatografi cair yang diperbolehkan untuk meningkatkan pemisahan antara senyawa yang sangat mirip.

Pada tahun 1980-an HPLC sering digunakan untuk pemisahan senyawa kimia. Meningkatkan teknik-teknik baru pemisahan, identifikasi, pemurnian dan kuantifikasi jauh di atas teknik-teknik sebelumnya. Komputer dan otomatisasi menambah kenyamanan HPLC. Perbaikan dalam kolom jenis dan dengan demikian reproduktifitas dibuat sebagai istilah-istilah seperti mikro-kolom, kolom afinitas, dan Fast HPLC mulai immerge. 

Dekade terakhir telah melihat usaha yang luas dalam pengembangan mikro-kolom, dan kolom khusus lainnya. Dimensi kolom HPLC yang khas adalah: XXX mm panjang dengan diameter internal antara 3-5 mm. Diameter yang biasa mikro-kolom, atau kolom kapiler, berkisar dari 3 μm sampai 200 μm. Fast HPLC menggunakan kolom yang lebih singkat dari kolom yang khas, dengan panjang sekitar 3 mm lama, dan mereka dipenuhi dengan partikel yang lebih kecil. 

Saat ini, satu memiliki pilihan untuk mempertimbangkan lebih dari banyak jenis kolom untuk pemisahan senyawa, serta berbagai detektor untuk antarmuka dengan HPLC dalam rangka mendapatkan analisa optimal kompleks. Walaupun HPLC secara luas dianggap sebagai suatu teknik terutama untuk bioteknologi, biomedis, dan riset biokimia serta untuk industri farmasi, bidang ini terdiri corrently hanya sekitar 50% dari pengguna HPLC. (Analytical Chem. Vol 62, no. 19, Oktober 1 1990). Saat ini HPLC digunakan oleh berbagai bidang termasuk kosmetik, energi, makanan, dan lingkungan industri.

HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.

             HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen dalam campuran.
             Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography, HPLC) merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan merupakan fasa cair dan zat padatnya merupakan fasa diam (stasioner). Teknik ini sangat berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai afinitas selektif antara fasa diam tertentu dan fasa gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu tambat serta tinggi puncak suatu senyawa.

2.2. Sistem Peralatan HPLC

Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak, pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom, detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau integrator atau perekam.

faktor-faktor yang harus diperhatikan :

1.     tekanan pompa

2.     kecepatan alir fase gerak

3.     jenis kolom

4.     fase gerak (bisa tunggal atau campuran cairan, bahkan gradien konsentrasi)

5.     suhu (kadang-kadang ada pemisahan yang perlu pengaturan suhu)

6.     jenis detektor (umumnya adalah spektrofotometer UV-Vis tapi ada jenis lain)

Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini :

1.  Wadah Fase gerak dan Fase gerak

Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut.

Fase gerak atau eluen biasanya terdiri atas campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel. Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik (fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatnya polaritas pelarut.

Fase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikel-partikel kecil ini. Selain itu, adanya gas dalam fase gerak juga harus dihilangkan, sebab adanya gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan mengacaukan analisis.

Elusi dapat dilakukan dengan cara isokratik (komposisi fase gerak tetap selama elusi) atau dengan cara bergradien (komposisi fase gerak berubah-ubah selama elusi) yang analog dengan pemrograman suhu pada kromatografi gas. Elusi bergradien digunakan untuk meningkatkan resolusi campuran yang kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran polaritas yang luas.

Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder.

Elusi Gradien menawarkan beberapa keuntungan :

a. Total waktu analisis dapat direduksi

b. Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

c. Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

Gradien dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.

Fase gerak yang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran larutan bufer dengan metanol atau campuran air dengan asetonitril. Untuk pemisahan dengan fase normal, fase gerak yang paling sering digunakan adalah campuran pelarut-pelarut hidrokarbon dengan pelarut yang terklorisasi atau menggunakan pelarut-pelarut jenis alkohol. Pemisahan dengan fase normal ini kurang umum dibanding dengan fase terbalik.

Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk HPLC, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

             1. Murni, tidak terdapat kontaminan

             2. Tidak bereaksi dengan wadah (packing)

             3. Sesuai dengan defektor

             4. Melarutkan sampel

             5. Memiliki visikositas rendah

             6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

             7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.

Menghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk HPLC yang menggunakan pompa bolak balik (reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing) juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara (contoh : kolom berikatan dengan NH2).

Ada dua perbedaan dalam HPLC, yang mana tergantung pada polaritas relatif dari pelarut dan fase diam.

Fase normal HPLC

Ini secara esensial sama dengan apa yang sudah anda baca tentang kromatografi lapis tipis atau kromatografi kolom. Kolom diisi dengan partikel silika yang sangat kecil dan pelarut non polar misalnya heksan. Sebuah kolom sederhana memiliki diameter internal 4.6 mm (dan mungkin kurang dari nilai ini) dengan panjang 150 sampai 250 mm.
Senyawa-senyawa polar dalam campuran melalui kolom akan melekat lebih lama pada silika yang polar dibanding degan senyawa-senyawa non polar. Oleh karena itu, senyawa yang non polar kemudian akan lebih cepat melewati kolom. 

Fase balik HPLC

Dalam kasus ini, ukuran kolom sama, tetapi silika dimodifikasi menjadi non polar melalui pelekatan rantai-rantai hidrokarbon panjang pada permukaannya secara sederhana baik berupa atom karbon 8 atau 18. Sebagai contoh, pelarut polar digunakan berupa campuran air dan alkohol seperti metanol. Dalam kasus ini, akan terdapat atraksi yang kuat antara pelarut polar dan molekul polar dalam campuran yang melalui kolom. Atraksi yang terjadi tidak akan sekuat atraksi antara rantai-rantai hidrokarbon yang berlekatan pada silika (fase diam) dan molekul-molekul polar dalam larutan. Oleh karena itu, molekul-molekul polar dalam campuran akan menghabiskan waktunya untuk bergerak bersama dengan pelarut.

Senyawa-senyawa non polar dalam campuran akan cenderung membentuk atraksi dengan gugus hidrokarbon karena adanya dispersi gaya van der Waals. Senyawa-senyawa ini juga akan kurang larut dalam pelarut karena membutuhkan pemutusan ikatan hydrogen sebagaimana halnya senyawa-senyawa tersebut berada dalam molekul-molekul air atau metanol misalnya. Oleh karenanya, senyawa-senyawa ini akan menghabiskan waktu dalam larutan dan akan bergerak lambat dalam kolom. Ini berarti bahwa molekul-molekul polar akan bergerak lebih cepat melalui kolom.

2. Pompa

Terdapat dua sistem pompa yaitu internal dan eksternal. Pada sistem internal, pompa dihidupkan, set laju aliran 0.1 mL/menit, tunggu sampai suhu kolom diatas 60°C, kemudian naikkan laju alirannya menjadi 0.5 mL/menit (setting ini berbeda untuk analisis zat yang lain). Sambil menunggu suhu kolom maka keluarkan gelembung udara pada pompa dengan bantuan syringe.

Pada sistem eksternal digunakan dua buah pompa, untuk campuran pelarut. Misalnya untuk memperbaiki pemisahan pada puncak yang terlalu dekat. Caranya dengan mengubah switch yang terletak pada panel belakang pompa dengan gradient controller. Buat program yang sesuai dengan pada gradient controller.

Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat, Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.

Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel, konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan.

Fase gerak dalam HPLC adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

3. Tempat penyuntikan sampel

Sampel-sampel cair dan larutan disuntikkan secara langsung ke dalam fase gerak yang mengalir di bawah tekanan menuju kolom menggunakan alat penyuntik yang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teflon yang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau eksternal.

              

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada dua model umum :

a. Stopped Flow

b. Solvent Flowing

Ada tiga tipe dasar injektor yang dapat digunakan :

a. Stop-Flow: Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

b.  Septum: Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

c.  Loop Valve: Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari 10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan masuK ke dalam kolom.

4. Kolom dan Fase diam

Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit. Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional, yakni:

·   Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit).

·   Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.

·   Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat, karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi, silika yang tidak dimodifikasi, atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH).

Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain. Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah, silika yang tidak dimodifikasi. Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. 

Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

Kolom analitik sedang, maupun tinggi. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti

a. Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada

jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

b.Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjang kolom 25 -100 cm.

Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model HPLC yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution Chromatography, EC)

Kolom pada kromatografi cair kinerja tinggi merupakan bagian yang sangat penting, sebab separasi komponen-komponen sampel akan terjadi di dalam kolom.

Oleh sebab itu, harus diperhatikan dengan seksama tiga hal berikut :

·       Pemilihan kolom yangs sesuai

·       Pemeliharaan kolom

·       Uji terhadap spesifikasi kolom (walaupun kolom tersebut merupakan kolom yang   siap pakai)

Kolom akan menjadi kunci penentuan keberhasilan pemisahan komponen-komponen sampel serta hasil akhir analisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi.

5. Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:

1. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel.
2. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil.
3. Stabil dalam pengopersiannya.
4. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita.
5. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier).
6. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak

Beberapa detektor yang paling sering digunakan pada HPLC antara lain :

Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.

Detektor HPLC yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain:

1.      Detektor Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa

2.      Detektor lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks

3.      Detektor Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia

Ada beberapa cara untuk mendeteksi substansi yang telah melewati kolom. Metode umum yang mudah dipakai untuk menjelaskan yaitu penggunaan serapan ultra-violet.

Banyak senyawa-senyawa organik menyerap sinar UV dari beberapa panjang gelombang. Jika anda menyinarkan sinar UV pada larutan yang keluar melalui kolom dan sebuah detektor pada sisi yang berlawanan, anda akan mendapatkan pembacaan langsung berapa besar sinar yang diserap.

Jumlah cahaya yang diserap akan bergantung pada jumlah senyawa tertentu yang melewati melalui berkas pada waktu itu. Anda akan heran mengapa pelarut yang digunakan tidak mengabsorbsi sinar UV. Pelarut menyerapnya! Tetapi berbeda, senyawa-senyawa akan menyerap dengan sangat kuat bagian-bagian yang berbeda dari specktrum UV.

Misalnya, metanol, menyerap pada panjang gelombang dibawah 205 nm dan air pada gelombang dibawah 190 nm. Jika anda menggunakan campuran metanol-air sebagai pelarut, anda sebaiknya menggunakan panjang gelombang yang lebih besar dari 205 nm untuk mencegah pembacaan yang salah dari pelarut.

Interpretasi output dari detektor

Output akan direkam sebagai rangkaian puncak-puncak, dimana masing-masing puncak mewakili satu senyawa dalam campuran yang melalui detektor dan menerap sinar UV. Sepanjang anda mengontrol kondisi kolom, anda dapat menggunakan waktu retensi untuk membantu mengidentifikasi senyawa yang diperoleh, tentunya, anda (atau orang lain) sudah mengukur senyawa-senyawa murninya dari berbagai senyawa pada kondisi yang sama.

Jika anda menginjeksi suatu larutan yang mengandung senyawa murni X yang telah diketahui jumlahnya pada instrumen, anda tidak hanya dapat merekam waktu retensi dari senyawa tersebut, tetapi anda juga dapat menghubungkan jumlah dari senyawa X dengan puncak dari senyawa yang dihasilkan.

Area yang berada dibawah puncak sebanding dengan jumlah X yang melalui detektor, dan area ini dapat dihitung secara otomatis melalui layar komputer. Area dihitung sebagai bagian yang berwarna hijau dalam gambar (sangat sederhana).
Jika larutan X kurang pekat, area dibawah puncak akan berkurang meskipun waktu retensi akan sama. Misalnya,

Ini berarti dimungkinkan mengkalibrasi instrumen sehingga dapat digunakan untuk mengetahu berapa jumlah substansi yang dihasilkan meskipun dalam jumlah kecil.

Dalam gambar, area di bawah puncak Y lebih kecil dibanding dengan area dibawah puncak X. Ini mungkin disebabkan oleh karena Y lebih sedikit dari X, tetapi dapat sama karena Y mengabsorbsi sinar UV pada panjang gelombang lebih sedikit dibanding dengan X. Ini mungkin ada jumlah besar Y yang tampak, tetapi jika diserap lemah, ini akan hanya memberikan puncak yang kecil.

Seperti dalam GC, detector merupakan bagian integral instrument LC analitis yang modern. Digunakan beberapa tipe, dengan pilihan umumnya didasarkan pada persyaratan kepekaan, macamnya senyawa dalam contoh, dan factor-faktor lain seperti biaya. Detektor biasanya didasarkan pada indeks bias dari eluat kolom, karena hampir zat terlarut apa saja akan menghasilkan suatu larutan yang indeks biasnya berbeda dari indeks bias pelarut. Detektor itu menginderai dan menurunkan suatu isyarat listrik yang proporsional, yang digandakan dan direkam untuk menghasilkan kromatogram. Pembatasan utama adalah kepekaannya; batas deteksi akan beraneka menurut keadaan, namun lazimnya disekitar satu microgram(10-6 g) zat terlarut. Suatu masalah tambahan adalah sangat bergantungnya indeks bias itu pada temperatur, yang menyebabkan perlunya mengendalikan temperature baik detector maupun larutan yang masuk dengan sangat seksama.

Detektor-detektor yang didasarkan pada fluoresens makin menjadi biasa. Tipe yang paling berguna memberikan eksitasi variable yang berkesinambungan sepanjang suatu jangkauan panjang gelombang yang lebar, dengan memanfaatkan suatu sumber berkesinambungan dan monokromator; biasanya digunakan filter-filter sederhana untuk meneruskan pancaran pendaran ke fotodetektor sambil menghalangi radiasi eksitansinya. 

2.3. Jenis HPLC

Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik.

Selain klasifikasi di atas, HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut, dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut:

1. Kromatografi Adsorbsi

Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. Gugus silanol pada silika mempunyai reaktifitas yang berbeda, karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor.

2. Kromatografi fase terikat

Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan fenil. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik.

Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat.

4.   Kromatografi penukar ion

HPLC penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran, meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin.

Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air, retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

5.   Kromatografi Pasangan ion

Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan.

6.   Kromatografi Eksklusi Ukuran

Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton.

Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel), atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekul-molekul yang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus, akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Dengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain.

7. Kromatografi Afinitas

Dalam kasus ini, pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks.

2.4. Derivatisasi Pada HPLC

Derivatisasi melibatkan suatu reaksi kimia antara suatu analit dengan suatu reagen untuk mengubah sifat fisika-kimia suatu analit. Tujuan utama penggunaan derivatisasi pada HPLC adalah untuk:

1. Meningkatkan deteksi
2. Merubah struktur molekul atau polaritas analit sehingga akan menghasilkan puncak kromatografi yang lebih baik
3. Merubah matriks sehingga diperoleh pemisahan yang lebih baik
4. Menstabilkan analit yang sensitive.

Detektor yang paling banyak digunakan dalam HPLC adalah detektor UV-Vis sehingga banyak metode yang dikembangkan untuk memasang atau menambahkan gugus kromofor yang akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu. Di samping itu, juga dikembangkan suatu metode untuk menghasilkan fluorofor (senyawa yang mamapu berfluoresensi) sehingga dapat dideteksi dengan fluorometri. Suatu reaksi derivatisasi harus mempunyai syarat-syarat sebagai berikut, yakni: produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar ultraviolet atau sinar tampak atau dapat membentuk senyawa berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri; proses derivatisasi harus cepat dan menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %); produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi; serta sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidakmenganggu pemisahan kromatografi.

Berbagai macam agen penderivat telah tersedia antara lain :

Derivatisasi ini dapat dilakukan sebelum analit memasuki kolom (pre-column derivatization) atau setelah analit keluar dari kolom (post-column derivatization

2.5. Kelebihan dan Kekurangan HPLC

Kelebihan dari teknik HPLC dibandingkan dengan GC ( Gas Chromatography) :

1.      Dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat yang tidak stabil

2.      Memiliki detector yang memiliki kepekaan yang tinggi

3.      Memiliki daya pemisahan yang tinggi

4.      Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya

5.      Dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit fase gerak yang dikonsumsi)

6.      Bahan yang digunakan untuk pelarut mudah dijumpai dan relative murah

7.      Dapat digunakan pada suhu kamar

2.6. Kegunaan HPLC :

HPLC digunakan untuk analisis senyawa non-volatile termasuk sampel ionik dan polimerik.HPLC dengan prinsip kromatografi adsorpsi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. Zat-zat dengan kepolaran berbeda, yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapiskan zat berpori.Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia dan penukar ion klasik. Asam-asam nukleat telah terpisahkan pada PLB, waktu analisisnya lebih pendek. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan pada resin Zipax-SAX. Penukar ion gel silica yang dimodifikasi secara kimia mempunyai kapsitas tukar tinggi, vitamin-vitamin yang larut dalam air misalkan telah dapat dipisahkan.Pemakaian HPLC pada kromatografi eksklusi dilakukan dengan kolom panjang, tujuan utama kerjanya tetap sama yaitu penentuan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia. Pada umumnya teknik ini dapat digunakan pada setiap metode kolom kromatografi.

Beberapa kegunaan HPLC :

1.      HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industry farmasi dan peptisida

2.      Zat-zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair

3.      Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yng dokombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat perpori

4.      Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air

5.      Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.

HPLC dibagi menjadi 5 jenis   :

1.      Adsorbsi

2.      Partisi

3.      Fasa terlihat

4.      Penukaran ion

5.      Eksklusi

  VII.            Alat dan Bahan                                  :

Alat        :

1.       Gelas Ukur 100 ml

2.       Labu Ukur 100 ml

3.       Corong pendek

4.       Batang pengaduk

5.       HPLC

6.       Neraca analitik digital

Bahan   :

a.       Sample paracetamol

b.      Standar paracetamol

c.       metanol

VIII.            Langkah Kerja                                    :

1.      Preparasi sample

2.      Standar dibuat dalam labu ukur 250 ml

3.      Sample diencerkan dari standar

a.      Pengoprasian Alat

1.      Hidupkan pum LC-20AT

2.      Hidupkan detector SPD-20A

3.      Hidupkan CBM-20A

4.      Hidupkan PC

5.      Sebelum mengoprasikan, saat mengganti fasa gerak sebaiknya dilakukan purginguntuk menghilangkan kotoran dan gelembung

6.      Di PC di menu windows, klik LC solution

7.      Klik gambar instrument 1

8.      Klik OK, akan muncul menu utama real time analysis

9.      Klik file

10.  Klik new method file

11.  Klik instrument parameter

12.  Klik advance untuk tampilan parameter detail

13.  Klik pump da nisi parameter sesuai kondisi yang diinginkan

14.  Klik toolbar detector, isi parameter d2 dengan parameter isi panjang gelombang

15.  Klik toolbar data acuistion isi parameter

16.  Simpan parameter

17.  Klik download untuk mengirim parameter ke system HPLC

18.  Hidupkan instrument, klik on/off

19.  Lakukan baseline tunggu hingga kolom result pass

a.      Injeksi Baku

1.      Pada menu utama real time analysis . klik data acaulsition

2.      Klik single start

3.      Isi parameter yang diinginkan

4.      Klik ok

5.      Lakukan injeksi baku dengan cara memutar tuas injector rheodyne ke posisi load. Injeksikan 10 mikro mili larutan baku. Putar kuas ke posisi inject analisis akan segera berlangsung

6.      Lakukan injeksi baku berikutnya

a.      Kalibrasi Baku

1.      Klik LC solution

2.      Klik postrun

3.      Klik calibration

4.      Klik toolbar data

5.      Klik 2 kali data file yang akan dijadikan standar

6.      Klik wizard

7.      Atur parameter yang diinginkan

8.      Klik next

9.      Beri tanda check list pada puncak yang dijadikan peak targetsesuai waktu retensi masing masing

10.  Klik next

11.  Isi parameter yang diinginkan

12.  Klik next

13.  Isi parameter toleransi waktu retensi

14.  Klik next

15.  Isi nama dan konsentarsi komponen masing” sesuai waktu retensinya

16.  Klik finish

17.  Klik apply to method

18.  Klik yes

19.  Isi nama dan save

20.  Klik top

21.  Klik batch processing

22.  Klik file new

23.  Klik toolbar data

24.  Drag data yang dibutuhkan

25.  Klik batch start

    IX.            Data Pengamatan                                            :

Title	Sample name	Sample ID	Ret. Time	Area	Resolution	Conc
Standar	Paracetamol	Std2	3.103	31304	0.634	10
Sample	Paracetamol	Smpl2	3.012	31663	0.621	9.8
Average			3.058	31484	0.628	9.9
%RSD			1.929	58.504	0.436	58.504
Maximum			3.103	31663	0.634	10
Minimum			3.012	31304	0.621	9.8
Standar Deviation			0.091	359	0.013	0.2

 [ sample ]           =  9.8 ppm

      X.            Pembahasan                                      :

1.       Sample dan standar harus disaring agar taka da padatan padatan dan mineral mineral yang sangat kecil yang pada saat pengukuran akan menyumbat pipa kapiler

2.       Pada saat analisis sebaiknya pada saat pengukuran sample dan standar harus dimasukan pada entang waktu yang sama atau jangan di klik start pada saat single start karena waktu retensi yang dialami akan berbeda atau bertambah dan pada saat beres engukuran tuas injector rheodyne jangan dibuka karena alat akan membaca kembali zat yang dianalisa

3.       Pembilasan harus menggunakan aqua bides dikarenakan agar tidak adanya ikroorganisme dan mineral yang akan masuk ke dalam kolom yang nantinya akan merusak HPLC

    XI.            Kesimpulan                                        :

Dari hasil praktikum diperoleh [PARACETAMOL] dalam sample sebesar 9.8 ppm

  XII.            Daftar Pustaka                                  :